chao 1和ACE是衡量物种丰富度的指标，和丰度、均匀度无关，对稀有的物种很敏感/
香农指数描述中的个体出现的紊乱和不确定性，不确定性越高，多样性就越高，香浓指数对群落的丰富度及稀有otu更敏感
聚类：DADA2
降噪：
ZOTUs 质心正确
ASV：质量值
分类：基于比对法、机器学习，两者结合
（条形图和热图）
多样性：a多样性和b多样性
a：Chao1（丰富度），Shannon指数（丰富度和稀有OTU），Simpson指数（对多样性即均匀度和丰富度，优势OTU更敏感）
b多样性：加权和非加权，基于独立OTU和基于系统发生树
相似性分析：分析组间差异是否大于组内差异，越接近1说明组间差异越大。
Adonis：置换多因素方差，分析不同分组因素对样品差异的解释度，置换检验来进行显著性分析，R2取值范围为【0，1】，越接近1说明分组因素对样品差异的解释度越高。
细菌微生物多样性和真菌微生物多样性
聚类：根据序列的相似性，聚类一些OTU
降噪：发现样品中真实的生物序列，模式不同
基于得到的特征表，进行各种分析
保守区-情缘关系
可变区-差异性
注意
一、研究对象和方法：
1. 细菌16S rDNA（1.5kb），保守区亲缘关系，可变区物种差异，
真菌ITS1，18S rDNA（1.8kb） 藻类、原生动物，
功能基因：固氮基因，硝化和反硝化。。。
2. 研究方法：
二代：短reads，短高变区V3+V4，V4等，只提供科或属级别分类；
三代：超长的测序读长，16S全长，在属和种水平上分类。
二、分析方法与结果:
多样性分析软件，物种分类，多样性分析，组间差异分析，关联分析，功能预测分析
1. 数据质控，聚类/降噪；
2. 物种分类：参考数据库，物种分布丰度，分布热图；
3. 多样性分析：
4. 组间差异分析
5. 相关性：RDA/CCA，相关性系数（Pearson，Spearman），网络图、表；
6. 功能预测分析：
微生物多样性
1.研究对象与方法：人粪便（疾病与微生物的关系）
2.研究方法：16s rDNA(细菌多样性)
3.分析结果：物种分析、多样性分析、组间差异分析、关联分析、功能预测分析。
4.数据质控：
4.1二代：PE reads拼接——引物序列识别——Tags过滤
4.2三代：CCS识别——引物序列识别——Tags过滤
5.聚类和降噪
聚类：OTU（序列相似性）
降噪：
6.物种分布：（歌物种组成）
7.多样性（A:内部 ：辛普森多样性指数）——箱线图
B：样品距离（加权与非加权）
相似性差异：（ANOSIM）：箱线图—PCA
8.组间差异：（相对丰度）
9.相关性与关联分析：
9.1排序分析：RDA/CCA
9.2相关系数分数
9.2网络分析（）
10.功能预测分析
10.1
0716 学习
1.微生物研究对象：
2.研究方法（功能）：细菌、真菌、功能基因
3.测序方法：二代测序--科属水平分类，短reads
三代测序--超长的，属/种水平鉴定
pacbio全长测序：序列扩增-加接头-识别ccs序列
4.分析方法和结果：
原始数据-聚类-特征表/序列
--》物种分类图
--》多样性分析
--》组间差异性分析
--》关联分析（物种与物种之间，物种与环境之间的关系）
--》功能预测分析（推测样品功能--重复以上4个分析作图）
数据质控（剔除低质量数据）-方法
聚类/降噪
聚类--基于序列相似性得到OTU，一个OTU中可能包含一些具有不同表型的菌株或物种的生物序列
降噪--ZOTUS 和 ASVs两种方法
实例解释：
物种分类：鉴定物种所在的等级
1.基于比对：blast/vsearch: 特征序列与参考数据库对比，找出一致性最高的
2.基于机器学习（贝叶斯、决策树）
3.比对结合机器：
物种分类分析：样品组成情况、各物种在不同样品中的丰度趋势变化--》热图的颜色变化
多样性分析：α多样性和β多样性
α多样性：单个样品物种丰富度以及物种多样性
衡量指标有：Chao 1和ACE，香浓、辛普森
- Chao 1和ACE：衡量物种丰富度，和丰度、均匀度无关；只对稀有物种敏感；
- Shannon(香浓指数）：描述物种出现的紊乱和不确定性，对群落的丰富度和稀有OTU更敏感。
- 辛普森多样性指数：群落中种数越多，个体分配就越均匀，指数越低，群落多样性越高，对均匀度和群落中的优势OTU更敏感。
β多样性分析：描述样品间的差异性
组间差异分析（比较组间和组内差异的大小）：箱线图和PCoA图
相似性分析（ANOSIM）：R值接近1，表示组间差异>组内差异，是比较好的。
Adonis置换多因素方差分析：R²越接近1说明分组因素对样品差异的解释度就越高。
组间差异分析（比较物种组与组之间的差异）：常见的方法--T检验；方差分析；秩和
常见的问题：1.哪一种分析方法都有应用，多多尝试不同的方法；2.目前多样性分析的差异结果，一般还需要更多的重复和验证，才能最终加以说明。
相关性和关联分析： 主要研究的是 微生物与微生物、微生物与环境因子之间的相互作用，
有两类方法：
- 排序分析（RDA/CCA db-RDA)，坐标系射线与射线之间的夹角反应关系；
- 一种基于相关性系数 （Pearson、Spearman、Sparce)--》热图、网络图
功能预测分析：PICRUSt2计算方法--利用标记基因数据和一个参考基因组数据库来预测微生物功能组成。
