ONT的核心技术：纳米孔测序（nanopore）

单分子测序：Motor马达蛋白牵引，将DNA双链解旋，并控制DNA链穿孔速度，一条链完成穿过孔，该纳米孔可继续对其他DNA链进行测序。

纳米孔测序特点：

长度长、直接测序（不需要甲基化修饰）、实时、按需要测序、灵活、可扩展

一张芯片有2048Mux(multiplexer)多路复用器，有512个放大器

先用180mV电压，每10min颠倒一下电压方向，让电流短时间反走一下，激活被堵住的pore ，每2h增加5mV电压（随着电极被用的时间越来越长，电极的电压会发生漂移）

测定过程Nanopore建议严格保持在34℃

R9芯片，DNA链在pore中穿过的速度是250个碱基/s,10min可以测到全长15万个碱基的单链（250*60*10=150000）

2048个Mux中，有1200个Mux能正常工作。原因如下：

1.Mux中没有穿膜的蛋白小孔，或者蛋白小孔不通；

2. 膜破掉：几个pore都各自有DNA链通过，信号相互干扰；

三、DNA建库

1. 1D文库& 1D2文库

1D2文库的两端上专门加了1D2接头，可以让第二链紧跟在第一链后面被测序

1D，是指建出来的库，正义链和反义链完全分离开；测序的时候分别被单独测序的

1D建库有两种建库方法：

1）用标准的加接头的方式来建库；

先用DNA的两端补齐，末端加上A碱基，连上接头。注：这时候接头上已经带了一个Motor蛋白，也就是动力蛋白（目前是DNA解旋酶），然后加上一个Tether蛋白。

Tether蛋白起到的作用是把DNA链吸附在测序芯片的膜上，让它不容易飘走

2）用转座子来建库；

已经连了接头序列的转座子酶，与长链DNA混合之后，酶把长链DNA切断，在DNA的断点上加上接头，再加上带着动力蛋白的测序接头，再加上Tether蛋白