进化分支图：黄色的点代表没有差异的物种，带有颜色的点代表差异物种；
LDA值分布柱状图：展示了所有物种的LDA值
丰度比较图：标记物种在多组
操作步骤：
一、样品间分析：选择样品--分类水平选择（OTU或其他）---样品聚类或排序（聚类或排序均可选，默认聚类）--距离算法选择（binary jaccard）------提交
表格展现了样品中距离矩阵的数据，数值越大，两样品之间的差异越大；
图片展示了每个样品的聚类结果，不同的颜色表示不同的物种的丰度，红色表示两两样品之间的差异大，蓝色表示两两样品之间的差异小
二、组间分析：选中treat1（对来自同一组的样品标记同一颜色），其他同上
最后的分析结果可以保存和下载
多维空间的研究对象简化到低维空间进行定位、分析和归类。
操作步骤：
一、样品间分析：
选择样品---分类水平选择（OTU或其他）--- 距离算法的选择（计算样品与样品之间的距离，根据实际情况选择，这里选择binary jaccard）---提交
表格：样品、组和坐标信息
图片：点代表了不同的样品，不同颜色代表了不同的分组，可以修改图片，选择是否选择样品名称，选择加圈（置信椭圆，有五个样品才可做这个），是否进行组间差异检验（任意选择一种），主标题（NMDS），X轴标题（nmds1），Y轴标题（nmds2），点击确定
二、组间分析：同上
最后的分析结果可以保存和下载
操作步骤：
一、样品间分析：同下（组间分析会将不同样品标记不同的颜色，这个不会）
二、组间分析：选择样品---分类水平选择（OTU或其他）---提交
表格：样品坐标表（展示了每一个样品在第一轴、第二轴、第三轴的具体的坐标信息）
各坐标解释度表（反映了第一轴、第二轴、第三轴的贡献率）
图片：从三个层次反映PCA分析的结果（第一轴和第二轴；第一轴和第三轴；第二轴和第三轴）
点表示了不同的样品，点的颜色代表了分组信息；可以点击修改图片，选择是否选择样品名称，选择加圈（置信椭圆，有五个样品才可做这个），是否进行组间差异检验（任意选择一种），主标题（PCA），X轴标题（PC1），Y轴标题（PC2），点击确定
同一组样品添加了置信椭圆
最后的分析结果可以保存和下载
操作步骤：
一、样品间分析：选择样品---分类水平选择（OTU或其他）---提交
表格：OTU的ID、后面是没哟个OTU在不同样品中的序列条数
图片：横坐标：物种丰度从高到低的排序顺序；纵坐标：物种的相对丰度。曲线下降的平缓程度反映物种分布的均匀程度，曲线下降越平缓反映样品中物种分布越均匀。
二、组间分析：同上
最后的分析结果可以保存和下载
一、样品间分析：选择样品---分类水平选择（OTU或其他 ）---提交
表格：样品ID、随机抽取的序列条数、当前抽取的序列条数下所得到的Shannon指数
图片：横坐标：随机抽取的序列条数；纵坐标：Shannon指数大小。不同颜色的线条表示不同的样品。
二、组间分析：同上
最后的分析结果可以保存和下载
一、样品间分析：选择样品---分类学水平选择（OTU水平或其他）---多样性指数选择（都选上）---提交
表格 展示了计算的各指数及其在95%可信区间下的最小值和最大值的结果分析
二、组间分析：选择样品---分类学水平选择（OTU水平或其他）---多样性指数选择（都选上）---组间差异检验方法，选择T检验或其他---提交
表格 展示了具体的指标信息、分组信息
第一行表示Shannon指数在各组之间的平均值，第二行表示Shannon指数在各组之间的标准差。
图片展示了alpha多样性指数在三组之间的差异性的情况，可以点击箭头看各个图片
操作步骤：
一、样品间分析：选择样品---分类学水平选择（genus水平或其他）---提交，表格展示了物种的分类学等级及物种在三个样品中的相对丰度信息
图片三个顶点表示三个样品，不同的点是不同的属，点的大小表示属的相对丰度的大小，不同的颜色表示不同的门，某个点距离某个顶点越近，表示该物种的丰度在该顶点所代表的样品中越高。
二、组间分析：同上
最后的分析结果可以保存和下载
基于代表序列，通过多序列比对构建物种间的系统进化关系
操作步骤：
一、样品间分析：选择样品---分类水平选择（genus水平或其他）---物种数量选择（微生物丰度20或其他，丰度比例1%或其他）---提交（分析时间较长），表格展示了所选的OTU、OTU在样品中的丰度的总和及该OTU的物种注释信息，图片有两种（环形进化树、常规进化树）
二、组间分析：同上
最后的分析结果可以保存和下载
操作步骤：
一、样品间分析：选择样品---提交（分析时间较长），图片从里到外分别表示了分类等级从高到低(界门纲目科属种)，扇形面积大小表示了该分类等级的丰度信息，双击扇形可以把所有分类等级下的所有物种分类信息放大，查看该分类等级下的所有物种信息。
二、组间分析：同上
最后的分析结果可以保存和下载
一、样品间分析：选择样品---提交（分析时间较长）
图片从左到右分别表示了从高到低(界门纲目科属种)的分类学地位，饼图中不同的颜色表示不同的样品，饼图所在的位置展示了当前分支下无法继续分类的序列条数，饼图不同颜色的面积大小表示了在该位置的序列条数的高低
二、组间分析：同上
以颜色梯度反应物种在不同样品间的丰度差异，并根据物种的丰度相似性对样品和物种进行聚类
操作步骤：
一、样品间分析：选择样品--分类水平选择（OTU）---点击中心数字，确定，上面表格会展示共有OTU--点击花瓣上的数字，确定，上面表格会展示特有OTU
表格展现了OTU在不同样品中的序列条数，若某个OTU值为0，则该样品中不存在该OTU；图片展示了共有或特有OTU，需自己选择点击花瓣数字
二、组间分析：同上
Lefse在不同组间寻找具有统计学差异的差异物种。然后再通过LDA做线性判别分析，找每个差异物种对组间差异的贡献。有LDA值表示组间差异的大小，LDA值越高，表明这一物种对组间差异值的贡献越大。
由里到外是界门纲目科属种。
横坐标代表按照丰度排序的序号，纵坐标代表OTU的相对丰度
意义：（1）代表样品里面物种的丰富度，曲线末端对应横坐标值越高，该样品中OTU的数量越多，说明里面的物种越多。纵坐标越高，值越大，说明该样品中物种的丰富度越高
（2）曲线的平缓代表样品中物种均匀性高，陡峭代表样品中物种均匀性不好
Beta多样性分析
主成分分析：
共线率越高，越能反应原始信息，图中不同颜色反应不同样品
中间的10244，核心基因所在的共有家族，还有分化出的单拷贝直系同源基因家族 ，利用分化出的单拷贝直系同源基因做出系统进化树，这是一种通过单拷贝直系同源基因，进行共线性比对，做基因家族聚类做出的系统进化树
扩张，就是最后的拷贝出的基因家族的增加或减少，+代表扩张，-代表减少。
碱基的变化导致编码的氨基酸变化/没变化，即为非同义替换/同义替换
基因组水平共线性--后种方法
基因水平共线性---选前种方法
7.19 第2课 Beta多样性分析
0716 学习
1.微生物研究对象：
2.研究方法（功能）：细菌、真菌、功能基因
3.测序方法：二代测序--科属水平分类，短reads
三代测序--超长的，属/种水平鉴定
pacbio全长测序：序列扩增-加接头-识别ccs序列
4.分析方法和结果：
原始数据-聚类-特征表/序列
--》物种分类图
--》多样性分析
--》组间差异性分析
--》关联分析（物种与物种之间，物种与环境之间的关系）
--》功能预测分析（推测样品功能--重复以上4个分析作图）
数据质控（剔除低质量数据）-方法
聚类/降噪
聚类--基于序列相似性得到OTU，一个OTU中可能包含一些具有不同表型的菌株或物种的生物序列
降噪--ZOTUS 和 ASVs两种方法
实例解释：
物种分类：鉴定物种所在的等级
1.基于比对：blast/vsearch: 特征序列与参考数据库对比，找出一致性最高的
2.基于机器学习（贝叶斯、决策树）
3.比对结合机器：
物种分类分析：样品组成情况、各物种在不同样品中的丰度趋势变化--》热图的颜色变化
多样性分析：α多样性和β多样性
α多样性：单个样品物种丰富度以及物种多样性
衡量指标有：Chao 1和ACE，香浓、辛普森
- Chao 1和ACE：衡量物种丰富度，和丰度、均匀度无关；只对稀有物种敏感；
- Shannon(香浓指数）：描述物种出现的紊乱和不确定性，对群落的丰富度和稀有OTU更敏感。
- 辛普森多样性指数：群落中种数越多，个体分配就越均匀，指数越低，群落多样性越高，对均匀度和群落中的优势OTU更敏感。
β多样性分析：描述样品间的差异性
组间差异分析（比较组间和组内差异的大小）：箱线图和PCoA图
相似性分析（ANOSIM）：R值接近1，表示组间差异>组内差异，是比较好的。
Adonis置换多因素方差分析：R²越接近1说明分组因素对样品差异的解释度就越高。
组间差异分析（比较物种组与组之间的差异）：常见的方法--T检验；方差分析；秩和
常见的问题：1.哪一种分析方法都有应用，多多尝试不同的方法；2.目前多样性分析的差异结果，一般还需要更多的重复和验证，才能最终加以说明。
相关性和关联分析： 主要研究的是 微生物与微生物、微生物与环境因子之间的相互作用，
有两类方法：
- 排序分析（RDA/CCA db-RDA)，坐标系射线与射线之间的夹角反应关系；
- 一种基于相关性系数 （Pearson、Spearman、Sparce)--》热图、网络图
功能预测分析：PICRUSt2计算方法--利用标记基因数据和一个参考基因组数据库来预测微生物功能组成。
