ANOVA分析门水平p大于0.05就是门水平没有差异性吗

笔记

注意

1. PCA：多维数据转为二维坐标，去冗余和降噪

2. PCoA: 

3. NMDS：点之间距离表示差异大小，stress值反映分析可靠性，<0.01分析结果极为可靠的；

4. UPGMA：枝长越短，差异越小；

一、研究对象和方法：

1. 细菌16S rDNA（1.5kb），保守区亲缘关系，可变区物种差异，

真菌ITS1，18S rDNA（1.8kb） 藻类、原生动物，

功能基因：固氮基因，硝化和反硝化。。。

2. 研究方法：

二代：短reads，短高变区V3+V4，V4等，只提供科或属级别分类；

三代：超长的测序读长，16S全长，在属和种水平上分类。

二、分析方法与结果:

多样性分析软件，物种分类，多样性分析，组间差异分析，关联分析，功能预测分析

1. 数据质控，聚类/降噪；

2. 物种分类：参考数据库，物种分布丰度，分布热图；

3. 多样性分析：

4. 组间差异分析

5. 相关性：RDA/CCA，相关性系数（Pearson，Spearman），网络图、表；

6. 功能预测分析：

微生物多样性

1.研究对象与方法：人粪便（疾病与微生物的关系）

2.研究方法：16s rDNA(细菌多样性)

3.分析结果：物种分析、多样性分析、组间差异分析、关联分析、功能预测分析。

4.数据质控：

4.1二代：PE reads拼接——引物序列识别——Tags过滤

4.2三代：CCS识别——引物序列识别——Tags过滤

5.聚类和降噪

聚类：OTU（序列相似性）

降噪： 

6.物种分布：（歌物种组成）

7.多样性（A:内部 ：辛普森多样性指数）——箱线图

B：样品距离（加权与非加权）

相似性差异：（ANOSIM）：箱线图—PCA

8.组间差异：（相对丰度）

9.相关性与关联分析：

9.1排序分析：RDA/CCA

9.2相关系数分数

9.2网络分析（）

10.功能预测分析

10.1

1列：生物标记的名称

2列：对应的丰富

3列：生物标记所在的分组

目的：以网络图的形式展示了物种与物种之间的相关性

操作步骤：

一、样品间分析：选择样品--分类水平选择（genus或其他）---物种数量选择（微生物丰度TOP：80）--相关性类型（Spearman）---相关系数阈值0.1---显著性P值0.05---提交

表格展现了物种1、物种2、两物种之间相关性数值大小、二者之间相关性类型（+：二者正相关，-：二者负相关）；

网络图图片，点表示不同的物种，连线表示物种之间有相关性、粗细表示相关性的强弱，红色表示正相关，绿色表示负相关

二、组间分析：

一、样品间分析：选择样品--分类水平选择（genus或其他）---物种数量选择（微生物丰度TOP：20）--聚类分析选择（选择物种聚类）--样品聚类或排序（样品聚类，若需要对样本排序，则选中，再手动对上面的样品进行排序）--相关性类型（SparCC或其他）---相关系数阈值（0.1）--显著性p值（0.05）-上传环境因子数据或手动写--提交

表格：相关性系数表展现了物种与环境因子的相关性系数；p值表表示了物种与环境因子之间相关性的显著性

相关性热图图片相关性以*表示

一、样品间分析：选择样品--分类水平选择（genus或其他）---距离算法选择（binary jaccard）----环境因子距离算法选择（手动或上传文件）----提交

表格展现了 环境因子名称、检验得到的r值（表明环境因子）、统计学检验的显著性；

二、组间分析：

使用非参数T检验方法研究两组样品微生物群落丰度的差异，

一、分析类型选择（只能进行两两组之间的分析）：选择样品（添加新的分组类型，新建分组策略名称：treat2，左下角添加分组至分组池，在分组池创建两个分组，确认，选中我们创建的分组）—-分类水平选择（genus水平）--显著性P值（0.05）------提交

表格展现了物种名称、物种在第一组中的均值、方差、标准差、物种在第二组中的均值、方差、标准差，最后两列为P值和校正后的P值；

我们可以选择感兴趣的物种，点击上方在图片中展示选中的物种，图片中会显示该物种在两组之间差异的柱状图及物种的散点图。

进化分支图：黄色的点代表没有差异的物种，带有颜色的点代表差异物种；

LDA值分布柱状图：展示了所有物种的LDA值

丰度比较图：标记物种在多组

操作步骤：

一、样品间分析：选择样品--分类水平选择（OTU或其他）---样品聚类或排序（聚类或排序均可选，默认聚类）--距离算法选择（binary jaccard）------提交

表格展现了样品中距离矩阵的数据，数值越大，两样品之间的差异越大；

图片展示了每个样品的聚类结果，不同的颜色表示不同的物种的丰度，红色表示两两样品之间的差异大，蓝色表示两两样品之间的差异小

二、组间分析：选中treat1（对来自同一组的样品标记同一颜色），其他同上

最后的分析结果可以保存和下载

多维空间的研究对象简化到低维空间进行定位、分析和归类。

操作步骤：

一、样品间分析：

选择样品---分类水平选择（OTU或其他）--- 距离算法的选择（计算样品与样品之间的距离，根据实际情况选择，这里选择binary jaccard）---提交

表格：样品、组和坐标信息

图片：点代表了不同的样品，不同颜色代表了不同的分组，可以修改图片，选择是否选择样品名称，选择加圈（置信椭圆，有五个样品才可做这个），是否进行组间差异检验（任意选择一种），主标题（NMDS），X轴标题（nmds1），Y轴标题（nmds2），点击确定

二、组间分析：同上

最后的分析结果可以保存和下载

操作步骤：

一、样品间分析：同下（组间分析会将不同样品标记不同的颜色，这个不会）

二、组间分析：选择样品---分类水平选择（OTU或其他）---提交

表格：样品坐标表（展示了每一个样品在第一轴、第二轴、第三轴的具体的坐标信息）

各坐标解释度表（反映了第一轴、第二轴、第三轴的贡献率）

图片：从三个层次反映PCA分析的结果（第一轴和第二轴；第一轴和第三轴；第二轴和第三轴）

点表示了不同的样品，点的颜色代表了分组信息；可以点击修改图片，选择是否选择样品名称，选择加圈（置信椭圆，有五个样品才可做这个），是否进行组间差异检验（任意选择一种），主标题（PCA），X轴标题（PC1），Y轴标题（PC2），点击确定

同一组样品添加了置信椭圆

最后的分析结果可以保存和下载

操作步骤：

一、样品间分析：选择样品---分类水平选择（OTU或其他）---提交

表格：OTU的ID、后面是没哟个OTU在不同样品中的序列条数

图片：横坐标：物种丰度从高到低的排序顺序；纵坐标：物种的相对丰度。曲线下降的平缓程度反映物种分布的均匀程度，曲线下降越平缓反映样品中物种分布越均匀。

二、组间分析：同上

最后的分析结果可以保存和下载

一、样品间分析：选择样品---分类水平选择（OTU或其他 ）---提交

表格：样品ID、随机抽取的序列条数、当前抽取的序列条数下所得到的Shannon指数

图片：横坐标：随机抽取的序列条数；纵坐标：Shannon指数大小。不同颜色的线条表示不同的样品。

二、组间分析：同上

最后的分析结果可以保存和下载

一、样品间分析：选择样品---分类学水平选择（OTU水平或其他）---多样性指数选择（都选上）---提交

表格 展示了计算的各指数及其在95%可信区间下的最小值和最大值的结果分析

二、组间分析：选择样品---分类学水平选择（OTU水平或其他）---多样性指数选择（都选上）---组间差异检验方法，选择T检验或其他---提交

表格 展示了具体的指标信息、分组信息

第一行表示Shannon指数在各组之间的平均值，第二行表示Shannon指数在各组之间的标准差。

图片展示了alpha多样性指数在三组之间的差异性的情况，可以点击箭头看各个图片

操作步骤：

一、样品间分析：选择样品---分类学水平选择（genus水平或其他）---提交，表格展示了物种的分类学等级及物种在三个样品中的相对丰度信息

图片三个顶点表示三个样品，不同的点是不同的属，点的大小表示属的相对丰度的大小，不同的颜色表示不同的门，某个点距离某个顶点越近，表示该物种的丰度在该顶点所代表的样品中越高。

二、组间分析：同上

最后的分析结果可以保存和下载

基于代表序列，通过多序列比对构建物种间的系统进化关系

操作步骤：

一、样品间分析：选择样品---分类水平选择（genus水平或其他）---物种数量选择（微生物丰度20或其他，丰度比例1%或其他）---提交（分析时间较长），表格展示了所选的OTU、OTU在样品中的丰度的总和及该OTU的物种注释信息，图片有两种（环形进化树、常规进化树）

二、组间分析：同上

最后的分析结果可以保存和下载