操作步骤：

一、样品间分析：选择样品---提交（分析时间较长），图片从里到外分别表示了分类等级从高到低(界门纲目科属种)，扇形面积大小表示了该分类等级的丰度信息，双击扇形可以把所有分类等级下的所有物种分类信息放大，查看该分类等级下的所有物种信息。

二、组间分析：同上

最后的分析结果可以保存和下载

一、样品间分析：选择样品---提交（分析时间较长）

图片从左到右分别表示了从高到低(界门纲目科属种)的分类学地位，饼图中不同的颜色表示不同的样品，饼图所在的位置展示了当前分支下无法继续分类的序列条数，饼图不同颜色的面积大小表示了在该位置的序列条数的高低

二、组间分析：同上

以颜色梯度反应物种在不同样品间的丰度差异，并根据物种的丰度相似性对样品和物种进行聚类

操作步骤：

一、样品间分析：选择样品--分类水平选择（OTU）---点击中心数字，确定，上面表格会展示共有OTU--点击花瓣上的数字，确定，上面表格会展示特有OTU

表格展现了OTU在不同样品中的序列条数，若某个OTU值为0，则该样品中不存在该OTU；图片展示了共有或特有OTU，需自己选择点击花瓣数字

二、组间分析：同上

Lefse在不同组间寻找具有统计学差异的差异物种。然后再通过LDA做线性判别分析，找每个差异物种对组间差异的贡献。有LDA值表示组间差异的大小，LDA值越高，表明这一物种对组间差异值的贡献越大。

由里到外是界门纲目科属种。

横坐标代表按照丰度排序的序号，纵坐标代表OTU的相对丰度

意义：（1）代表样品里面物种的丰富度，曲线末端对应横坐标值越高，该样品中OTU的数量越多，说明里面的物种越多。纵坐标越高，值越大，说明该样品中物种的丰富度越高

（2）曲线的平缓代表样品中物种均匀性高，陡峭代表样品中物种均匀性不好

Beta多样性分析

主成分分析：

共线率越高，越能反应原始信息，图中不同颜色反应不同样品

中间的10244，核心基因所在的共有家族，还有分化出的单拷贝直系同源基因家族 ，利用分化出的单拷贝直系同源基因做出系统进化树，这是一种通过单拷贝直系同源基因，进行共线性比对，做基因家族聚类做出的系统进化树 

扩张，就是最后的拷贝出的基因家族的增加或减少，+代表扩张，-代表减少。

碱基的变化导致编码的氨基酸变化/没变化，即为非同义替换/同义替换

基因组水平共线性--后种方法

基因水平共线性---选前种方法

7.19 第2课 Beta多样性分析

0716 学习

1.微生物研究对象：

2.研究方法（功能）：细菌、真菌、功能基因

3.测序方法：二代测序--科属水平分类，短reads

三代测序--超长的，属/种水平鉴定

pacbio全长测序：序列扩增-加接头-识别ccs序列

4.分析方法和结果：

原始数据-聚类-特征表/序列

--》物种分类图

--》多样性分析

--》组间差异性分析

--》关联分析（物种与物种之间，物种与环境之间的关系）

--》功能预测分析（推测样品功能--重复以上4个分析作图）

数据质控（剔除低质量数据）-方法

聚类/降噪

聚类--基于序列相似性得到OTU，一个OTU中可能包含一些具有不同表型的菌株或物种的生物序列

降噪--ZOTUS  和 ASVs两种方法

实例解释：

物种分类：鉴定物种所在的等级

1.基于比对：blast/vsearch: 特征序列与参考数据库对比，找出一致性最高的

2.基于机器学习（贝叶斯、决策树）

3.比对结合机器：

物种分类分析：样品组成情况、各物种在不同样品中的丰度趋势变化--》热图的颜色变化

多样性分析：α多样性和β多样性

α多样性：单个样品物种丰富度以及物种多样性

衡量指标有：Chao 1和ACE，香浓、辛普森

• Chao 1和ACE：衡量物种丰富度，和丰度、均匀度无关；只对稀有物种敏感；
• Shannon(香浓指数）：描述物种出现的紊乱和不确定性，对群落的丰富度和稀有OTU更敏感。
• 辛普森多样性指数：群落中种数越多，个体分配就越均匀，指数越低，群落多样性越高，对均匀度和群落中的优势OTU更敏感。

β多样性分析：描述样品间的差异性

组间差异分析（比较组间和组内差异的大小）：箱线图和PCoA图

相似性分析（ANOSIM）：R值接近1，表示组间差异>组内差异，是比较好的。

Adonis置换多因素方差分析：R²越接近1说明分组因素对样品差异的解释度就越高。

组间差异分析（比较物种组与组之间的差异）：常见的方法--T检验；方差分析；秩和

常见的问题：1.哪一种分析方法都有应用，多多尝试不同的方法；2.目前多样性分析的差异结果，一般还需要更多的重复和验证，才能最终加以说明。

相关性和关联分析： 主要研究的是 微生物与微生物、微生物与环境因子之间的相互作用，

有两类方法：

• 排序分析（RDA/CCA db-RDA)，坐标系射线与射线之间的夹角反应关系；
• 一种基于相关性系数 （Pearson、Spearman、Sparce)--》热图、网络图

功能预测分析：PICRUSt2计算方法--利用标记基因数据和一个参考基因组数据库来预测微生物功能组成。